الف- عنوان تحقیق 

1- عنوان به زبان فارسی:

بررسی وجود تراژن در برخی از نمونه برنج های موجود در بازار ایران

2-  عنوان به زبان انگليسي/(آلماني، فرانسه، عربي):

Evaluation of transgenic genes in some rice samples of iranian market

ب – تعداد واحد پايان‏نامه:  6

ج- بيان مسأله اساسي تحقيق به طور كلي (شامل تشريح مسأله و معرفي آن، بيان جنبه‏هاي مجهول و مبهم، بيان متغيرهاي مربوطه و منظور از تحقيق) :

برنج گياهي است از رده تك لپه اي ها متعلق به تيره گرامينه(poaceae) و زير تيره اوري زوئيده وجنس اوريزا. جنس اوريزا داراي 25 گونه مختلف است . نوع زراعتي آن با نام علمی oryza sativa است که داراي n=242 عددکروموزم مي باشد. شواهد نشان می‌دهند که تقریبا 4000 سال قبل از میلاد ، در کشورهای هند و چین ، کشت برنج متداول بوده است. بر اساس خصوصيات مورفولوژيکي وفیزيولوژيکي وتوافق جغرافيائي ورايته هاي برنج به گروه های مختلفی تقسيم مي شود که به ترتيب اقسام آن عبارتند از: indica  ،japanica  و javanica .گياه برنج از كاشت تا برداشت به 80 تا 270 روز زمان نياز دارد .برنج گياهي است معمولا روز كوتاه ويكساله ولي بعضي از انواع چند ساله آن نیز موجود مي باشند. برنج داراي ساقه اي راست وتوخالي است كه ارتفاع آن بين 200-50 سانتي متر ، تعداد برگ بين 10 تا 20 عدد و قطر ساقه برنج بين 6 تا 12 ميلي متر متغير است. هر بوته برنج معمولا 4 تا 5 پنجه توليد مي‌كند. برگ برنج شامل پهنك و غلاف بلندي است.زبانك يا ليگول برنج غشايي و بلند بوده ودر موقع رسيدن شكاف بر مي دارد اين زبانك غشايي سه گوش بوده و داراي طولي در حدود 15-10 ميلي متر است. گل آذين در برنج به صورت پانيكول بوده ودر انتها واقع شده است. از محل هر گره محور اصلي خوشه يك يا چند انشعاب اوليه بوجود مي آيد. كه بعدا از همين انشعابات اوليه، چندين انشعابات ثانويه توليد مي شود كه بعد از هر يك از اين انشعابات ثانوي يك يا چند خوشه چه يا تك گل بوجود مي‌آيد. گل شامل مادگي، پرچم ها مي باشد. مادگي شامل كلاله ها، خامه وتخمدان مي‌باشد. كلاله پري شكل از دو شاخه تشكيل يافته است. تعداد پرچم در برنج برخلاف اکثر غلات 6 عدد مي باشد. ميوه برنج گندمه بوده، بدين معني كه پوسته هاي ميوه وپوسته دانه با هم رشد مي نمايد. دانه برنج داراي رنگ هاي مختلفي از قبيل زرد، سفيد، قرمز وسياه است.وزن هزار دانه برنج در حدود 40-20 گرم است. در دانه برنج خارجی ترین لایه پریکارپ نام دارد که  سخت و شفاف است. پوست دانه زیر این بخش قرار گرفته که از لحاظ پروتئین و چربی غنی ، ولی از نظر نشاسته‌ای فقیر است. پس از پوست ، لایه آلورن است که بخش خارجی از آندوسپرم محسوب می گردد. بنابراین بدلیل عمل پوست کنی ، بخش عمده‌ای از مواد مغذی برنج از دست می‌رود. از لحاظ پروتئینی برنج گلوتن ندارد، پروتئین عمده آن اوریزنین (oryzenin ) می‌باشد. ترکیب اصلی برنج ، نشاسته است که عمدتا در آندوسپرم قرار دارد.
برنج یکی از مهم‌ترین غلات و از گیاهان علفی مهم در قاره آسیاست. پس از گندم ، برنج دومین غله مهم در دنیا به حساب می‌آید. بر اساس آمار سازمان خواربار جهانی(FAO) نزدیک به 90 درصد سطح زیر کشت و تولید برنج متعلق به کشورهای آسیایی می‌باشد و بیش از نصف محصول برنج هم در دو کشور هند و چین تولید می‌شود. بطور کلی ، کشورهای گرمسیری و نیمه گرمسیری برمه ، تایلند ، ویتنام ، لائوس ، اندونزی ، فیلیپین ، پاکستان ، هند ، آمریکا ، ژاپن ، ایتالیا ، مصر ، چین ، برزیل ، کوبا ، مکزیک و استرالیا از تولید کنندگان برنج به شمار می‌آیند.

با افزایش جمعیت جهان نیاز به تامین مواد غذایی بیش از پیش احساس می گردد در این میان گیاه برنج به عنوان یک محصول استراتژیک نقش مهمی در این زمینه دارد. برنج ماده غذايي بسيار مهمي در امنيت غذايي ايران و جهان است، بنابراین کنترل خسارت های وارده به تولید برنج و افزایش تولید در واحد سطح از اهمیت قابل ملاحظه ای برخوردار است. قسمت عمده خسارت که باعث کاهش تولید برنج می شود را می توان در دوبخش استرس های زنده ( افات، بیماریها و ..) و استرس های غیر زنده ( خشکی، شوری،سرما و…) تقسیم بندی کرد. امروزه با توجه به پیشرفتهای صورت گرفته در ژنتیک گیاهی استفاده از مهندسی ژنتیک به عنوان یکی از راه حل های مقابله با این استرس ها و همچنین افزایش تولید، بسیار مورد توجه قرار گرفته بطوریکه بخشی از تولید برنج در کشور های مختلف از این طریق صورت می گیرد.
بر طبق تعریف فائو بیوتکنولوژی شامل هر نوع استفاده تکنیکی از سیستم های بیولوژیکی، ارگانیسم های زنده به منظور ایجاد و تغییر فرآورده ها جهت مصارف خاص می باشد این مفهوم نه تنها شامل تکنولوژی DNA ی نوترکیب نظیر مهندسی ژنتیک برای تولید ارگانیسم های تراریخته می باشد بلکه سایر جنبه های بیوتکنولوژی غیر تراریخته نظیر ژنومیکس، پروئتومیکس، اصلاح به کمک نشانگرها، ریز ازدیادی و ابزارهای تشخیص را شامل می شود. هدف از این امر :1- تولید واریته های مقاوم به ویروس   2- تولید واریته های تراریخته مقاوم به قارچ ها 3- تولید واریته های تراریخته مقاوم به آفات و علفکش ها 4 – تولید واریته های تراریخته مقاوم به تنش های غیر زیستی 5- تولید واریته های تراریخته با ویژگی های بهبود یافته 6- اصلاح ویژگی های فیزیولوژیکی جهت افزایش عملکرد خواهد بود
اولین کار مطالعاتی و عملیاتی برای تولید برنج از طریق مهندسی ژنتیک، توسط toriyama et al, (1988)     و Zhang and Wu (1988)   با روش PEG(polyethylene glycol-mediated transformation)  برای انتقال DNA لخت به پرتوپلاست برنج با موفقیت صورت گرفت. پس از تا به امروز دیگر محققان با استفاده از توسعه روشهای انتقال توسط اگروباکتریوم، بمباران ژنی و الکتروپوریشن و .. با انتقال ژن مورد نظر خود توسط یکی از این روش ها، موفق به تولید محصولاتی با مقاومت بالاتر نسبت به استرس های محیطی مانند مقاومت به شوری، آفات مانند مقاومت به کرم ساقه خوار و بیماریها مانند مقاومت به سوختگی غلاف برنج شدند که در بخش مرور منابع به توضیح بیشتر آن پرداخته خواهد شد.
با وجود اینکه بسیاری از کمپانی های بزرگ معتقدند که محصولات تراریخته بی خطر می باشند ولی برخی محققان ایمنی زیستی معتقدند که تغییرات ژنتیکی موجودات غیر قابل پیش بینی است. هنوز در مراحل اولیه ارزیابی علمی و ایمنی محصولات تراریخته قرار داریم ولی به دلیل بازار اقتصادی و سود کلانی که این محصولات به همراه داشته اند خیلی سریع وارد بازارهای تجاری دنیا گردیده اند. از جمله ایرادهای اساسی که در خصوص نحوه تولید این محصولات وارد است مکان تصادفی ژن های استفاده شده و انتقال افقی ژن می باشد بنابراین اثرات غیر قابل پیش بینی را به همراه خواهد داشت که گیاه برنج تراریخته نیز از این امر مستثنی نیست.

د – اهمیت و ضرورت انجام تحقيق (شامل اختلاف نظرها و خلاءهاي تحقيقاتي موجود، ميزان نياز به موضوع، فوايد احتمالي نظري و عملي آن و همچنين مواد، روش و يا فرآيند تحقيقي احتمالاً جديدي كه در اين تحقيق مورد استفاده قرار مي‏گيرد):

براساس آمار سازمان خواروبار جهانی(FAO) کشت محصولات تراریخته در سال 2013 حدود 175.2 میلیون هکتار بوده و این محصولات در 19 کشور در حال توسعه از جمله برزیل، آرژانتین، چین و هندوستان، آفریقای جنوبی،  میانمار، مکزیک، سودان، شیلی و کوبا… و هشت کشور توسعه یافته از جمله آمریکا، اسپانیا، پرتقال، استرالیا و… کشت می‌شود. اولین کار مطالعاتی و عملیاتی برای ایجاد تراریختگی در برنج، توسط toriyama et al, (1988)  و Zhang and Wu (1988)  با روش PEG(polyethylene glycol-mediated transformation)  برای انتقال DNA لخت به برنج با موفقیت صورت گرفت و پس از آن مطالعات گسترده ای برای تولید برنج های تراریخته که نسبت به تنش های مختلف از جمله آفات، بیماریها و تنش های محیطی مقاوم باشند انجام شده است. بر طبق آمار گمرک ایران، در سال 92 مقدار یک میلیون و 956 هزار تن برنج به کشور وارد شده و همچنین بر اساس آمارهای وزارت جهادکشاورزی دو میلیون و ۴۰۰ هزار تن  برنج از شالیزارهای کشورمان استحصال شده است که بر این اساس حدود چها میلیون و 400 هزار تن برنج  از محل تولید داخل و واردات برای کشورمان تامین شده است. از انجا که محصولات وارداتی شناسنامه معلومی ندارند انجام تحقیقی ژنتیکی برای آگاهی از ماهیت مولکولی انها ضروری به نظر می رسد. هدف اصلی لزوم ایجاد اگاهی از جانب تولید کنندگان یا وارد کنندگان در مورد مسائل ایمنی زیستی می باشد. اهمیت بررسی این برنج ها از نظر روش تولید و اگاهی از مواد تشکیل دهنده و همچنین دادن حق انتخاب به مصرف کننده برای قبول یا عدم استفاده از محصول تراریخته این نیاز را ایجاب می کند تا تحقیقات کاملی در این زمینه صورت بگیرد . با توجه به گستردگی نظرات و عقاید در زمینه ایمنی زیستی و خلا تحقیقاتی موجود گام اول تست و تفکیک محصولات  از نظر روش تولید و ماهیت مولکولی آنها می باشد.

ه- مرور ادبیات و سوابق مربوطه (بيان مختصر پیشینه تحقيقات انجام شده در داخل و خارج کشور پيرامون موضوع رساله دکتری و نتايج آنها و مرور ادبیات و چارچوب نظري تحقیق):

اولین کار مطالعاتی و عملیاتی برای تولید برنج از طریق مهندسی ژنتیک، توسط Toriyama et al, (1988) و zhang (1988) and wu با روش PEG (polyethylene glycol-mediated transformation)  برای انتقال DNA لخت به پرتوپلاست برنج با موفقیت صورت گرفت.در قدم بعدی Matsuki et al, (1989)  در سال بعد موفق به متمرکز کردن ژن نشانگر gus در بافت آوندی توسط کاست ژنی با پروموتور rolC ، ژن نشانگر gus و ترمیناتور nos  با روش انتقال الکتروپوریشن شدند.در ادامه تحقیقاتی در زمینه ایجاد مقاومت به استرس های زنده از جمله آفات و بیماریها صورت گرفت که بر این مبنا Hayakawa et al, (1992) با استفاده از روش الکتروپوریشن و کاست ژنی با پروموتور 35s و ترمیناتور nos و ژن های  i1(CATB)-RSV CPموفق به ایجاد مقاومت در برنج در برابر  stripe virus شدند. در حدود سه سال بعد از طریق روش بمباران ژنی انتقال ژن i(ACT1)-PIN II با استفاده از پروموتور و ترمیناتور PINII مقاومت در برابر کرم ساقه خوار صورتی  ایجاد شدDuan et al, 1996)). در زمینه استفاده از روش انتقال با اگروباکتریوم ، برای ایجاد مقاومت در برابر آفات کرم ساقه خوار زرد و کرم ساقه خوار راه راه Cheng et al, (1998)  با استفاده از کاست های ژنی با پروموتور 35s و همچنین پروموتور UBI1 و ژن های cry1Ab و cry1Ac و ترمیناتور nos  موفق به ایجاد مقاومت در برنج گشتند.

همزمان کار بر روی ایجاد مقاومت در برابر بیماری های برنج نیز صورت می گرفت که می توان به Tang et al, (2001) اشاره نمود که با استفاده از روش بمباران ژنی و کاست ژنی با پروموتور 35s و ژن های SP-AP1 و ترمیناتور nos  موفق به افزایش مقاومت در برابر باکتری  Xanthomonas Oryzae شدند. همچنین Kumar et al, (2003)   با استفاده از اگروباکتریوم و کاست ژنی با پروموتور UBI1  و ژن CHI IIو ترمیناتور  nos به بررسی تحمل در برابر پاتوژن سوختگی غلاف ( شیت بلایت)، R.solani  پرداختند. در همان سال ایجاد مقاومت بالا به سوختگی غلاف برنج با کاست ژنی با پروموتور UBI1 و ژن های i(UBI1)-CH1 II و ترمیناتور  nos نیز با موفقیت انجام شد(Sridevi et al, 2003). دو سال بعد Hu et al, (2005) موفق به افزایش تحمل نسبت به استرس های قارچی با استفاده از کاست ژنی با پروموتور 35s و ژنOSSERK1 و ترمیناتور nos شدند که با استفاده از روش اگروباکتریوم صورت گرفت. Jiang et al, (2006) نیز از طریق روش اگروباکتریوم با استفاده از کاست ژنی با پروموتور 35s و ژن Xa5 و ترمیناتور nos مقاومت به بیماری سوختگی را ایجاد کردند.
در زمینه افزایش مقاومت نسبت به استرس های محیطی می توان به Hoshida et al, (2000) اشاره نمود که با استفاده از روش الکتروپوریشن و کاست ژنی با پروموتور 35s و ژن های i(CAT)-TP-GS2 و ترمیناتور  nos موفق به افزایش مقاومت نسبت به شوری گشتند.سه سال بعد  Agarwal et al, (2003) با استفاده از اگروباکتریوم و کاست ژنی با پروموتور UBI1 و ژن AtHSP101 و ترمیناتور  nos موفق به افزایش مقاومت نسبت به دمای بالا شدند.
برای بهبود در زمینه مقاومت در برابر علف کش ها هم ژن هایی به برنج منتقل شد که می توان به انتقال ژن های CYP2B6/C9/C18/C19 با پروموتور 35s و ترمیناتور nos اشاره کرد که این انتقال با روش PEG صورت گرفت (Ohkawa, 2002). برای ایجاد مقاومت به طیف گسترده ی علف کش ها Kawahigashi et al, (2006) با استفاده از کاست ژنی با پروموتور 35s و ژن های AMV5 UTR-CYP2B6,CYP1A1,CYP2C19 و ترمیناتور nos  و استفاده از روش اگروباکتریوم موفق به ایجاد مقاومت در برابر چند علف کش بصورت همزمان شدند.

و – جنبه جديد بودن و نوآوري در تحقيق:

تا کنون آزمایشی روی برنج وارداتی و تولیدی از نظر وجود تراژن در ایران گزارش نشده است.

ز- اهداف مشخص تحقيق (شامل اهداف آرماني، کلی، اهداف ويژه و كاربردي):

بررسی حضور یا عدم حضور تراژن در 5 محصول وارداتی و سه رقم اصلاح شده داخلی که با بررسی کاست ژنی انجام می گردد و عوامل درگیر در کاست مورد ارزیابی مولکولی قرار می گیرد.

ح – در صورت داشتن هدف كاربردي، نام بهره‏وران (سازمان‏ها، صنايع و يا گروه ذينفعان) ذكر شود (به عبارت دیگر محل اجرای مطالعه موردی): –

ط-  سؤالات تحقیق:

آیا در محصولات وارداتی ترمیناتور Nos وجود دارد؟
آیا در محصولات وارداتی پروموتور Camv35s دیده می شود؟
آیا در محصولات وارداتی تراژن وجود دارد؟
آیا در ارقام اصلاح شده داخلی ترمیناتور Nos وجود دارد؟
آیا در ارقام اصلاح شده داخلی پروموتور Camv35s دیده می شود؟
آیا در ارقام اصلاح شده داخلی تراژن وجود دارد؟

ی-  فرضيه ‏هاي تحقیق:

فرض بر این است که در ارقام وارداتی ترمیناتور nos وجود دارد.
فرض بر این است که در ارقام وارداتی پروموتور camv 35s  دیده می شود.
فرض بر این است که در ارقام وارداتی تراژن وجود دارد.
فرض بر این است که در ارقام اصلاح شده داخلی ترمیناتور nos وجود دارد.
فرض بر این است که در ارقام اصلاح شده داخلی پروموتور camv 35s دیده می شود.
فرض بر این است که در ارقام اصلاح شده داخلی تراژن وجود دارد.

ک- تعريف واژه‏ها و اصطلاحات فني و تخصصی (به صورت مفهومی و عملیاتی):

تراژن : یک ژن یا محتوای ژنتیکی است که به صورت طبیعی یا توسط یکی از روش‌های مهندسی ژنتیک از یک موجود زنده به موجود زنده‌‌ی دیگر، منتقل می‌شود. بر این اساس ما می‌توانیم به صورت بالقوه فنوتیپ موجود زنده را تغییر دهیم.

تراریخته : به محصولاتی که از طریق مهندسی و اصلاح ژنتیک تغییراتی در آنها بوجود آمده محصولات تراریخته می‌گویند

ترمیناتور :  توالی از ژن است که عوامل نسخه برداری از ژن با رسیدن به ان توالی به کار خود پایان می دهند

پروموتور : توالی از ژن است که محل اتصال عوامل رونویسی را مشخص می کند همچنین میزان و شدت بیان یک ژن را در کنترل خود دارد.

5-روش شناسی تحقیق:

الف- شرح كامل روش تحقیق بر حسب هدف، نوع داده ها و نحوه اجراء (شامل مواد، تجهيزات و استانداردهاي مورد استفاده در قالب مراحل اجرايي تحقيق به تفكيك):
تذكر: درخصوص تفكيك مراحل اجرايي تحقيق و توضيح آن، از به كار بردن عناوين كلي نظير، «گردآوري اطلاعات اوليه»، «تهيه نمونه‏هاي آزمون»، «انجام آزمايش‏ها» و غيره خودداري شده و لازم است در هر مورد توضيحات كامل در رابطه با منابع و مراكز تهيه داده‏ها و ملزومات، نوع فعاليت، مواد، روش‏ها، استانداردها، تجهيزات و مشخصات هر يك ارائه گردد.
پس از بررسی مقالات به انتخاب دو منطقه حفاظت شده روی تراژن های مختلف می پردازیم و سپس به استخراج DNA از دانه های سفید برنج پرداخته پس از حصول موفقیت برای اثبات حضور تراژن با استفاده از پرایمر اختصاصی، PCR اختصاصی انجام داده و نتایج بر روی ژل آگارز برده می شود، الکتروفورز صورت می گیرد. این نتایج با کمک ژن های خانزاد تایید می گردد ودر انتها حضور یا عدم حضور تراژن مشخص خواهد شد.

ب-  متغيرهاي مورد بررسي در قالب یک مدل مفهومی و شرح چگونگی بررسی و اندازه گیری متغیرها:

متغییرها شامل روشهای مختلف استخراج DNA از دانه سفید برنج و نیز بررسی مناطق حفاظت شده کاست های ژنی که در سال های اخیر به برنج انتقال یافته اند خواهد بودکه این امر با تایید شرایط و بررسی نمونه DNA  با کمک مقایسه الگوی باندی ژن های خانزاد صورت می گیرد. در همین راستا از 5 نمونه برنج وارداتی و 3 نمونه برنج اصلاح شده داخلی استفاده خواهد شد.

ج –  شرح کامل روش (ميداني، كتابخانه‏اي) و ابزار (مشاهده و آزمون، پرسشنامه،  مصاحبه،  فيش‏برداري و غيره) گردآوري داده‏ها :

بر اساس مطالعات انجام شده روی مقالات متعدد متغیر هایی از پروموتور و ترمیناتور جهت بررسی حضور تراژن انتخاب می گردد که بیشترین استفاده را در تحقیقات انجام شده، داشته است. در این راستا با مراجعه به مقالات موجود ابتدا کارهای صورت گرفته تفکیک شده، به دسته بندی پروموتورها و ترمیناتور ها همراه با روش انتقال تراژن می پردازیم. سپس به جستجوی پروتکل های استفاده شده در استخراج DNA، PCR و .. پرداخته، در ادامه بهترین روش برای استخراج DNA از دانه های سفید برنج را معرفی می کنیم و با انجام PCR  اختصاصی و مقایسه آن با الگوی باندی ژن های خانزاد به وجود یا عدموجود تراژن مورد جستجو پی می بریم.

د – جامعه آماري، روش نمونه‏گيري و حجم نمونه (در صورت وجود و امکان):

جامعه آماری شامل 5 نمونه وارداتی برنج و 3 رقم اصلاح شده داخلی و بعنوان شاهد دو ژن خانزاد در نظر گرفته خواهد شد.

هـ – روش‌ها و ابزار تجزيه و تحليل داده‏ها:

از طریق مشاهده و امتیاز دهی به الگوی باندی ژل الکتروفورز و مقایسه آن با الگوی باندی شاهد انجام خواهد شد.